Unidade VIII - Biologia Molecular

4. Técnicas de Hibridação

Essa técnica utiliza dois princípios dos ácidos nucléicos, que são a possibilidade de cortes no DNA por enzimas de restrição e a mobilidade do DNA por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, dada pelas cargas negativas na molécula, que submetido a um campo elétrico e em solução tampão, migrará para o polo positivo.

O DNA genômico extraído de uma célula, que deverá ser obtido em grandes quantidades e estar íntegro, após clivagem com enzimas de restrição, é submetido à eletroforese para separação das moléculas geradas pelo peso molecular dado em pares de bases (pb). Em seguida, o DNA é desnaturado em solução alcalina para ficar de fita simples e transferido para uma membrana de náilon. Uma sonda, constituída por uma pequena sequência de DNA complementar à sequência alvo, é marcada radioativamente ou alternativamente por marcações dita frias por colorimetria ou por fluorescência. Após marcação, a sonda formará um híbrido com o DNA alvo fragmentado, processo chamado de hibridação, e que está fixado na membrana nailon; ou seja, a sonda que encontra o alvo irá parear com o mesmo que está imobilizada na membrana. No caso de sondas quentes (radioativas), ao ser adicionado um substrato e exposição a um filme de raio-X, ocorrerá a marcação de pontos escuros (bandas) no filme .

Esse método foi descrito em 1975, sendo útil em vários experimentos, como na comparação inter e intra espécie, no fingerprinting em exames de vínculo genético, na comparação entre indivíduos de uma população, nas análises forenses, dentre outras. A base genética está no ganho ou perda de sítios de restrição nos diferentes alelos ou sequências de DNA, codificantes ou não. Devido às manchas geradas na radiografia, a técnica contém a palavra "blot" no nome.

A técnica é semelhante à descrita anteriormente e o nome Northern (norte) veio para contrapor a transferência de Southern (sul), sendo utilizado nas análises de expressão gênica após extração de RNA e fixação em membrana de nailon. A diferença no método está na não utilização de enzimas de restrição. Devido à alta instabilidade do RNA e sensibilidade ao ataque de RNases, os procedimentos devem ser realizados tomando cuidado com a contaminação por essas enzimas, utilizando reagentes inibidores de RNases, luvas limpas, e reagentes desnaturantes para separar as estruturas secundárias dos RNAs. Pode ser aplicada no estudo da expressão de um gene em um tecido em comparação a outros, determinar a expressão constitutiva ou induzida do gene, padrão de expressão temporal, por exemplo, associado ao crescimento dos indivíduos ou desenvolvimento do embrião, dentre outras.

Consiste na separação e caracterização de proteínas em géis de poliacrilamida na presença de reagentes desnaturantes para desnaturação de proteínas, necessária para separação de subunidades associadas à sua função. As proteínas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose e um anticorpo será utilizado para localização da proteína específica em um dado tecido. Um anticorpo secundário contra o primário é conjugado a um isótopo radioativo ou colorimétrico e quando o substrato é adicionado o produto resultante é visível, sendo útil nas análises de expressão de produtos gênicos codificantes específicos.