Unidade VIII - Biologia Molecular
3. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A PCR foi desenvolvida por Saiki (1985) e Mullis (1987) para amplificar segmentos de DNA. A PCR é considerada uma técnica revolucionária, por permitir estudar em detalhes a estrutura e expressão de genes por um processo de replicação, in vitro. Contudo, diferente das técnicas de Southern e Northern-Blot, que serão aqui descritas posteriormente, a sequência do gene que se pretende estudar deve ser conhecida. A PCR permite a análise de sequências de DNA ou RNA de fontes escassas de ácidos nucléicos e degradada, como sêmen e bulbo capilar, tendo, portanto, grande aplicação na área forense (identificação de pessoas) e criminalística, por uma análise de fingerprinting nos casos que envolvem identidade incerta ou busca de prováveis suspeitos. Atualmente, faz parte de muitos laboratórios de análises clínicas, não somente para investigação de paternidade, mas no diagnóstico de doenças genéticas hereditárias, doenças parasitárias, infecciosas, imunológicas.
Na PCR são utilizados primers que delimitam o alvo para iniciar a reação, a enzima DNA polimerase termoestável, cuja mais conhecida é a Taq DNA polimerase, que foi isolada da bactéria de fontes termais Thermus aquaticus, que realiza a síntese da nova fita a partir dos primers, os nucleotídeos (dNTPs), MgCl2 como cofator da Taq, um tampão para garantir a eficiência da reação e o molde de DNA extraído das células ou tecidos que se pretende estudar. A reação é realizada num aparelho denominado de termociclador, pois é pela variação de temperaturas, e não por um complexo com várias enzimas, como ocorre na replicação in vivo, que a PCR é feita.
A uma temperatura de cerca de 95ºC ocorre a desnaturação do DNA, entre 50-65ºC ocorre a ligação dos primers (tamanho variável) e a cerca de 72ºC a DNA polimerase irá fazer a adição de nucleotídeos a partir da extremidade 3-OH’ livre do primer. O DNA alvo poderá ser um gene ou parte dele, ou de qualquer sequência de bases genômicas do DNA que se pretenda analisar. A temperatura de anelamento dos primers será em função do tamanho e da composição de bases que possuem. A variação de ciclos para as etapas de desnaturação, anelamento/ligação do primers e extensão de nucleotídeos pela DNA polimerase é repetida por cerca de 35 ciclos para a amplificação (replicação) do DNA alvo.
