Palestras
3Práticas de Imunohistoquímica Aplicadas à Bioestrutura
Resumo
Imunohistoquímica (IHQ) é o conjunto de técnicas que têm por objetivo promover dados semi-quantitativos a expressão, distribuição e a localização de moléculas alvo (especialmente proteínas) presentes em células e/ou constituintes teciduais. Anticorpos monoclonais ou policlonais são utilizados para reconhecimento das moléculas alvo ou antígenos em uma interação química especifica antígeno-anticorpo. As técnicas de IHQ, são utilizadas para diagnóstico clínico de diversas patologias e para a pesquisa científica. Os anticorpos (também denominados marcadores) utilizados na IHQ determinam o tipo de técnica e podem ser fluorescentes (imunofluorescência) ou enzimático (fosfatase alcalina, peroxidase ou outros). Nessa capacitação, realizada durante o I Congresso Nacional de Bioestrutura Experimental e morfologia, discutimos e exploramos, de forma teórica, os conceitos básicos da IHQ, as diferentes formas de marcações, além de suas principais características e procedimentos metodológicos. Logo após a discussão teórica, foi realizado um procedimento prático com a marcação IHQ de membranas corioalantoide de galinhas com Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), com o objetivo de verificar a indução de angiogênese nesse tecido. Essa atividade prática permitiu aos participantes da capacitação o contato direto com uma das metodologias utilizadas no procedimento de marcação imunohistoquímica.
Palavras Chave: Imunohistoquímica, anticorpos, microscopia
Área temática: Técnicas mofológicas
Introdução
A técnica imunohistoquímica (IHQ) é conhecida pela utilização de anticorpos para detectar, localizar e situar antígenos (especialmente proteínas) presentes em células e tecidos. No entanto, na IHQ, diversos termos específicos são utilizados sendo, dessa forma importante determinar o significado de cada um, para evitar possíveis erros de conceituação. O termo imunomarcação é utilizado para determinar a reação onde se utiliza um ou mais anticorpos (primário e secundário), a imunocitoquímica refere-se a reações que empregam anticorpos com o foco na imunomarcação de células e a imunohistoquímica é o termo utilizado quando o objetivo é a imunomarcação de tecidos.
O princípio básico da técnica é a utilização de um anticorpo primário, que se liga diretamente a um antígeno que se deseja detectar na célula ou tecido. Na metodologia direta, o anticorpo primário possui, ligado em sua estrutura molecular, uma enzima, que ao reagir com seu substrato produz uma cor, ou um composto fluorescente, que quando estimulado emite fluorescência em determinado comprimento de onda. Essa coloração ou fluorescência permite a detecção, respectivamente, do sítio alvo em microscópio óptico ou de fluorescência. Na metodologia indireta é empregado um anticorpo secundário com uma enzima ou composto fluorescente ligado em sua estrutura. O anticorpo secundário se liga de forma específica ao anticorpo primário e produz a cor (quando em reação com substrato) ou a fluorescência (quando estimulado). O método indireto é mais sensível devido a múltiplas regiões em que o anticorpo secundário pode se ligar no anticorpo primário.
Preparo e Fixação
A IHQ é classificada em duas formas com base no tipo de processamento do tecido: (1) IHQ fixado em formalina e embebido em parafina (IHQ formalin-fixed, paraffin-embedded - FFPE), onde ocorre a fixação do tecido, seguido do emblocamento e corte em micrótomo. (2) IHQ Frozen (Fr), onde o tecido é congelado e cortado em criostato. A fixação do tecido ocorre antes ou após o crioseccionamento. A tabela 1 apresenta as principais características dos dois tipos de técnicas.
34| IHC-FFPE | IHC-Fr | |
|---|---|---|
| Fixação | A fixação é feita antes da incorporação em parafina | A fixação pode ser feito antes ou após o Crioseccionamento |
| Fixador comum | Formaldeído | Formaldeído ou álcoois |
| Armazenamento | As seções frescas devem ser cortadas após 4 semanas devido à perda de epítopos antigênicos. Seções de corte fresco não devem ser usadas depois de 1 mês. Para armazenamento a longo prazo (vários anos), recomenda-se o revestimento de deslizamento em parafina. |
Termo curto- 1 ano a -80 oC. |
| Maior vantagem | Facilidade de manipulação e preserva a morfologia estrutural. Os blocos podem ser armazenados a longo prazo. | Preserva a função de enzima e antígeno. Útil para estudo de pós-tradução proteína modificada, DNA ou RNA. |
| Maior limitação | Tempos de fixação variável. Fixação pode mascarar epítopos. | Os cristais de gelo podem impactar estrutura do tecido. |
Recuperação antigênica
A ação dos fixadores pode mascarar epítopos (regiões específicas do antígeno onde o anticorpo se liga), dificultando a ligação do antígeno ao anticorpo. Essa alteração pode resultar em baixo sinal de marcação (cor ou fluorescência) ou sinal indistinguível do background (fundo). Para a recuperação antigênica são utilizadas duas metodologias: (1) Calor (Heat-Induced Epitope Retrieval - HIER), onde o tecido cortado e colocado na lâmina é submetido ao calor na presença de soluções em pHs específicos (ex: tampão citrato, pH 6,0). (2) Enzimático (Protein-Induced Epitope Retrieval - PIER), com a utilização de proteinases (ex: tripsina ou proteinase K), capazes de clivar as proteínas (tabela 2).
| HIER | PIER | |
|---|---|---|
| Método | Calor | Enzimático |
| Processamento do tecido | FFPE e Fr | FFPE |
| Recomendação | Primeira escolha | Condição mais severa, favorecida para amostras com muitas ligações cruzadas |
Bloqueio de reações com enzimas endógenas
Alguns tecidos podem conter as mesmas enzimas que são ligadas aos anticorpos primários (reação direta) ou secundários (reação indireta) para a ligação ao substrato e geração de cor. Por exemplo, alguns tecidos possuem peroxidase, a mesma enzima utilizada para a detecção de cor utilizando a reação do substrato DAB (DABH2 + H2O2 ® DAB + 2H2O - geração de cor acastanhada). A tabela 3 evidencia os tecidos que possuem alta atividade enzimática e o método de bloqueio utilizada.
| Tecidos com alta atividade | Bloqueio | |
|---|---|---|
| Peroxidase | Rim, fígado ou vascular áreas com glóbulos vermelhos, membranas lisossômicas especialmente em células fagocíticas ativas | Colocar no corte de tecido3-10% de peróxido de hidrogênio em metanol antes da incubação com HRP conjugado anticorpo secundário. |
| Biotina | Fígado, rim, baço, coração, cérebro e pulmão ou tecidos congelados | Colocar no corte de tecido com avidina antes da incubação com reagentes conjugados com biotina. Em seguida, trate a amostra com biotina para bloquear locais adicionais de ligação à biotina na molécula de avidina. |
| Fosfatase | Intestino, rim, tecido linfoide | Adicionar na seção de tecido com 1 mM de Levamisol antes para incubação com anticorpo secundário conjugado AP. Para seções intestinais, bloqueie com 1% de ácido acético. |
| Autofluorescência | Pâncreas, cérebro, glóbulos vermelhos, outras células pigmentadas tipos, lipofuscina, componentes da matriz extracelular ou fixação de aldeído | Para autofluorescência de aldeídos, bloqueie com boro-hidreto de sódio em PBS. Escolha fluorocromos emitindo em comprimentos de onda não afetados. |
Bloqueio Não específico
Algumas forças que interações específicas podem contribuir para ligações não específicas, incluindo interações hidrofóbicas, interações ionicas e ligações de hidrogênio. Soluções comum para o bloqueio de interações não específicas são: BSA, Caseina ou tampões comerciais
Anticorpos e métodos de detecção
Os anticorpos utilizados em IHQ podem ser policlonais ou monoclonais. Os anticorpos policlonais são gerados a partir de múltiplos clones de linfócito B e por isso podem se ligar a diferentes epítopos de um mesmo antígeno. Já os anticorpos monoclonais são gerados por um único clone de célula B e se ligam a somente um epítopo. A tabela 4 apresenta as principais características dos dois tipos de anticorpos.
| Policlonal | Monoclonal | |
|---|---|---|
| Produção | Os Anticorpos são gerados de múltiplos clones de células B | Os Anticorpos são gerados por um único clone de células B |
| Epítopos Reconhecidos | Ligação a Múltipos epítopos do mesmo antígeno | Ligação a um simples epitopo |
| Vantagens | A ligação entre antígeno-anticorpo é menos afetada devido a mudanças na conformação do antígeno durante as etapas de preparação da amostra e fixação | Menor reação cruzada entre proteínas Redução da ligação não específica e menor background |
| Condições típicas de trabalho | Faixa de concentração 1,7-15ug/mL | Faixa de concentração: 5 – 25 ug/mL |
Aula Prática
Na aula prática foi realizado uma marcação de imunoperoxidade com o seguinte protocolo:
Os cortes das membranas corioalantoides foram desparafinizados e reidratadas foram submetidos à recuperação antigênica em tampão citrato pH 6,0 a 100°C por 10 minutos. Em seguida, os cortes foram lavados em PBS por 3 vezes de 5 minutos. O bloqueio de peroxidases endógenas foi realizado com peróxido de hidrogênio por 15 minutos e depois os cortes serão lavados em PBS por 3 vezes de 5 minutos. Os anticorpos primários (mouse monoclonal IgG, – Santa Cruz Biotecnology) para fator de crescimento vascular endotelial (Vascular Endothelial Growth Factor - VEGF) foram incubados em uma diluição de 1:100 a por 1 hora. Após serem lavados em PBS por 3 vezes, os cortes histológicos foram incubados por 45 minutos com anticorpo secundário (HRP Anti-mouse secundary antibodies) seguido pela detecção colorimétrica utilizando Kit DAB. Os tecidos foram contracoradas com hematoxilina e desidratadas com etanol de xilol e logo após montadas.
Referências
IMUNOHITOCHEMISTRY (IHC) HANDBOOK – Novus Biologicals – a bio-techne brand. https://www.google.com.br/search?q=Immunohistochemistry+(IHC)+Handbook+%E2%80%93+Novus+Biologicals+%E2%80%93+a+bio-techne+brand&spell=1&sa=X&ved=0ahUKEwiuu5Oz1NLXAhUFf5AKHeOaDq4QvwUIJCgA&biw=1242&bih=535. Acesso em 22/11/2017.
TOLOSA, C.E.M; RODRIGUES, C.J; BEHMER, O.A; NETO, A.G.F. Manual de Técnicas Para Histologia Normal e Patológica. Barueri, SP, Ed. Manole, 2003.